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CRISPR可谓是近年来生物界的焦点，其针对复杂有机体基因组特定位点中止操作（突变、插入或缺失）的伎俩对生物学和医药学的展开至关重要。这项技术相关于ZFN、TALEN等基因打靶技术能够说是烦琐、经济得多，普通的实验室都能够构建自己的平台。CRISPR/Cas9基因组编辑目前正应用得如火如荼，但若要转化到临床应用，精确检测脱靶效应则是必不可少的。 CRISPR脱靶带来的懊恼 早在2013年，来自麻省总医院的研讨人员发现运用CRISPR-Cas系统有一个重要局限：CRISPR-Cas会在预期靶点以外的位点上生成多余的DNA突变。尔后陆续有研讨直接阐明了CRISPR/Cas9存在严重的脱靶性，即该技术会发作非特异性切割，惹起基因组非靶向位点的突变，这样会构成研讨结果的不肯定性以及研讨工作的大量增加，这一问题也严重地限制了Cas9的应用。 在全基因组范围审定脱靶效应的措施时有报道，但这些措施有可能错过低频率的脱靶突变，而且高效转染的请求也限制了其应用。以往人们在检测CRISPR-Cas诱导的脱靶DNA断裂时，常常事前假定脱靶位点与靶位点相似。但是许多脱靶突变发作在与目的位点差别很大的中央，因而脱靶DNA断裂的数量和位置是很难预测的。GUIDE-seq是一种经过高通量实验伎俩在全基因组范围审定脱靶效应的措施，而且它相当灵活。 评价脱靶效应的利器——GUIDE-seq GUIDE-Seq高通量测序技术能够很好抑止以上问题，它极大提升检测通量，俭省实验时间，同时在低转染效率的状况下坚持高灵活度的低频突变检测效率，进步检测精确性。 其原理是，应用一种短双链寡核苷酸标签来标记CRISPR-Cas诱导的断裂（在靶和脱靶），然后对标签所在的基因区域中止高通量测序，最后应用生物信息学剖析肯定脱靶突变的位置以及突变频率。研讨表明，就算某个脱靶突变的呈现频率低至0.1%，经过GUIDE-seq也能够检测得到。
图1. GUIDE-seq剖析原理
图2. GUIDE-seq剖析流程 GUIDE-seq技术优势 现有脱靶评价工具主要是经过剖析目的序列来完成，但研讨显现，这些工具岂但在预测脱靶位点检测率低，还存在假阳性率高等状况（错误检出实践不被酶切位点）。 相比之下，GUIDE-seq不需求高效转染，从而避免了对细胞顺应性的影响。此外，活性核酸酶的浓度能够尽可能的高，从而将低频率突变一网打尽。同时，GUIDE-seq具有更高的信噪比，且需求的测序reads量少，在审定全基因组的脱靶位点时，它有望完成更高的灵活度。这种特性都使得GUIDE-seq在审定全基因组的CRISPR/Cas9脱靶突变上，比现有的细胞或生化措施表示更佳。 实验结果 经过GUIDE-seq高通量测序技术，对HEK293细胞系的三个靶点位置中止选择，最终选择出sgRNA在靶效率更高的site 2位点，从而提升了CRISPR编辑的精确性[1]。
注：第一行为预期靶序列（在靶位点），与靶序列不分歧的碱基则高亮显现；序列右侧为每个（在靶/脱靶）位点测序得到的reads数目；在靶序列用黑色实心方块标识。 如何设计实验？ 想应用这么方便的技术检测自己的CRISPR在靶效应，却不知道如何操作？联络我们，就会有专业的技术人员为你设计特定的短双链寡核苷酸标签。假如遇到实验问题，我们还会派发相关实验资料并指导客户中止简单的实验操作。 以下为送样参考：
参考文献： 【1】Tsai, S. Q. et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol33, 187–97 (2015). |
