NAT法|支原体qPCR检测和措施考证

近些年，随着生物医药迅猛展开以及新冠疫情下细胞基因治疗以及mRNA疫苗的相继涌现，如何把控生物制品保险牢靠，成为各国法规政府注重以及监管的要点。由于支原体是一种比较常见但通常难以去除的污染类型，所以关于触及细胞培育的生物制品工艺过程，法规请求“都必须确保无支原体污染”。

监管机构请求的支原体检测点

☆2020版中国药典三部《生物制品消费检定用动物细胞基质制备及质量控制》中提出关于消费用细胞，需求对主细胞库（MCB）、工作细胞库（WCB）、消费终末细胞（EOPC）中止支原体检查。

☆《免疫细胞治疗产品药学研讨与评价技术指导准绳（试行）》中倡议在关键时间点对合适的中间样品展开支原体等保险性相关检测或采取相关的措施加以控制，并且支原体同样需求作为终产品的放行检项。

☆FDA，Guidance for Industry :Characterization and Qualification of Cell Substrates and Other Biological Materials Used in the Production of Viral Vaccines for Infectious Disease Indications，中提出关于原资料、病毒种子、未加工的收获液等都需求中止支原体控制。

NAT法和传统措施

在快速检测措施（NAT，核酸扩增技术）呈现之前，传统的培育法和指示细胞法因其检测周期长或灵活度问题，致使企业消费或产品放行周期拉长或者需求基于风险评价对细胞原料中止条件放行或者寻求其他替代措施。而随着细胞基因治疗的展开，行业内对支原体检测时效性和灵活度请求越来越高，短的货架期缺乏以支撑如此长的检测周期，因而NAT措施从众多支原体检测措施中脱颖而出。

目前欧洲药典（EP）<2.6.7>，日本药典（JP） 以及美国药典（USP）<63>都已收录NAT措施作为支原体检测措施，但需求对该措施中止考证以及与传统措施中止对比其检测灵活度不低于传统措施，才能够运用。2020版中国药典（ChP）固然并未收录NAT法作为支原体检测措施，但其中也 提到了“也可采用经国度药品检定机构认可的其他措施”。2022年5月，国度药监局药审中心发布的《免疫细胞治疗产品药学研讨与评价技术指导准绳（试行）》中提到“当检验样品量有限，或需求快速放行等特殊状况下，如药典措施无法满足，可思索开发新型的无菌和支原体的检测措施中止放行检测，但是新型检测措施应经过充沛考证”。所以NAT法有望作为能够支持快速支原体放行检测的措施，被越来越多的原资料供给商、以及ATMP企业所运用。

NAT法-措施考证请求

关于如何中止NAT措施的考证，目前欧洲药典<2.6.7>和日本药典 里都细致引见，其内容基天职歧。中检院也发表了文章《支原体检查的核酸检测措施及措施学考证的思索》，以期对我国支原体核酸扩增法检测的研发者及运用者提供自创。支原体NAT法须中止专属性（Specificity）、检测限（Detection Limit）和耐用性（Robustness）考证。假如运用商业化试剂盒中止支原体检测，则能够基于供给商的完好试剂盒性能考证讲演再分离自身实验室环境和样品类型中止适合的措施适用性考证。

专属性（Specificity）

专属性系指在其他成分（如杂质、降解产物、辅料等）可能存在下，采用的剖析措施能正确测定出被测物的才干。EP中提到需求在考证中关注与系统发育关系比较近的其他细菌种属之间的交叉反响，如革兰氏阳性菌包含梭菌属Clostridium、乳杆菌属Lactobacillus和链球菌属Streptococcus。当然也需求关注宿主细胞和实验操作环境中比较常见的如人源DNA污染类型。

检测限（Detection Limit）

检测限系指试样中被测物能被检测出的最低量。检测限仅作为限度实验指标和定性鉴别的依据，不需求被准肯定量为一个精确值。EP中请求每种支原体每个稀释浓度都需求有24次检测数据，能够在不同天做3次独立的10倍系列梯度稀释，每个稀释梯度做8次重复检测；或者能够选择不同天做4次独立的10倍系列梯度稀释，每个稀释梯度做6次重复检测。检测阳性率需求满足95%以上能够作为检测限。

对需求中止检测限确认的支原体类型，试剂盒厂家需尽可能多的掩盖法规药典中请求的支原体类型，并需求对每种支原体的检测限中止探求。而关于生物制品企业来说，通常需求依据实践运用的原辅料来源中止选择。另外倡议把人源支原体类型思索进去。

*假如在消费过程中运用或接触禽细胞或资料，应中止滑液囊支原体的检测限考证；

**假如在消费过程中运用或接触昆虫或植物资料，应中止螺原体的检测限考证；

***猪鼻支原体在支原体污染样本中占比十分高，遭到中国食品药品检定研讨院的关注。

相比于欧洲药典，日本药典中关于需考证检测限的支原体中，并未提到鸡毒支原体而是增加了唾液支原体。

耐用性（Robustness）

耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的接受水平，为所树立的措施用于常规检验提供依据。关于耐用性的评价，需求关注支原体检测措施关于检测试剂中MgCl 2 、引物和dNTP的浓度变更，核酸提取试剂盒或提取步骤的改动以及运用不同核酸扩增仪的耐受水平。

可比研讨（Comparability Study）

假如要运用NAT替代药典措施，则需求经过对比确认NAT法能够替代培育法或者指示细胞培育法，通常需求思索措施的检测限，同时也需求把专属性（如掩盖的支原体范围以及可能的假阳性）思索进去。关于检测限的对比，需满足“检测限抵达10 CFU/mL，能够替代培育法；检测限抵达100 CFU/mL，能够替代指示细胞培育法”。

中止可比研讨有2种可选的方式：

1.运用相同考证支原体菌株，同时中止NAT法和药典措施的同步实验，确认检测限；

2.运用NAT法考证结果与之前的药典措施考证结果中止对比，但关于2种措施中运用的支原体规范品的确认文件需求认真记载。

NAT法支原体qPCR检测-完益处置计划

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