灌流生物反响器的表征：案例研讨

在下文中，我们将举例阐明一些案例研讨，其中，前面讨论的概念已被用于胜利地从实验室放大到消费范围。在第一部分，我们运用实验和计算工具讨论从 mL 到商业范围的不同反响器范围在混合、通气和流体动力应力方面的比较性表征研讨。接下来，我们运用 Bertrand 等人（2018 年）的组学研讨结果，比较不同范围的培育，不只在消费力和产质量量方面，也包含在细胞内过程水平上。最后，在继续讨论细胞截留装置的范围放大之前，我们将引见灌流设置的完好表征。

Villiger等人(2018) 对从微型到消费范围的不同动物细胞培育生物反响器中止了实验和计算比较研讨。该研讨偏重于发酵罐的比较，没有思索任何辅助设备，例如细胞截留装置。所思索的反响器如图 5.6 所示，包含一次性 15 mL ambr 微型生物反响器、2种不同的 3 L 范围玻璃容器反响器（具有不同的叶轮）和体积为 270 L、5,000 L 和15,000 L的大型不锈钢生物反响器。比较包含最大流体动力应力、混合时间、单位体积气-液传质系数和反响器内不同位置的溶氧浓度的实验测定。为了评价它们在反响器中的异质性，还经过计算流体动力学模仿计算了相同的数量。实验和计算结果都表明，固然 13.5 W/m3 的体积功率输入数坚持不变，但不同范围的剪应力散布和最大值存在很大差别。流体动力应力方式的差别主要是由于反响器几何外形不同。

图5.6不同反响器设置的表示图，从标称工作体积为10mL的mL范围 (ambr15系统)，到标称工作体积为3L的台式范围，再到标称工作体积为270、5,000和15,000L的消费范围。

最高应力值位于叶轮左近，而较低值位于叶轮上方。特别是关于 ambr 15 系统，经过 CFD 计算的流体动力应力散布表明，由于搅拌器的位置十分靠近底部，因而反响器体积中很大一部分的应力值相当低，这招致反响器顶部的区域混合不良。在每个范围上丈量或估量最大应力值（关于 5,000 和 15,000 L）。发现能量耗散率的最大值随体积系统地增加，固然它们实践上只出往常反响器体积内的一个十分小的区域中。关于混合时间，在相同的单位能量耗散率下，取得的值随着反响器体积的增加，从 3 L 系统中的几秒钟增加到 15,000 L 生物反响器中的简直2分钟。正如 Villiger 等人（2018）所察看到的那样，更长的混合时间是增加范围的必定结果。另一方面，为了避免细胞在酸性或碱性补液添加过程中裸露于非生理条件下，将异质性坚持在最低限度是关键。这关于连续培育来说更是如此，由于连续培育基置换需求对细胞培育液完成完整均质化。因而，假如处于细胞临界线以下并且能够接受，则应在消费范围上增加功率输入，以进步反响器的平均性。

氧气传输关于健康的培育至关重要。曾经有研讨经过将细胞悬液的 CFD 模仿与描画不同大小气泡行为的种群均衡方程相结兼并最终计算 k L a的平均值来剖析这一点。此外，在这种状况下，在不同的范围之间发现了十分不同的方式和值。结果突出了生物反响器配置在鼓泡、挡板、探针和搅拌方面对 k L a 的预期激烈影响。Villiger 等人（2018）的研讨表明，建模能够十分有效地辨认运转条件，主要是能量耗散率，优化反响器行为，例如，经过减轻大范围的不平均性和气体传质问题。但是，为了有效，这种措施需求分明天文解细胞系的剪切应力阈值。

Bertrand等人（2018 年）针对工业补料分批平台，在 15 mL 微型生物反响器和 300 L 中试范围生物反响器中中止了蛋白质组学剖析，以研讨反响器范围对工艺性能的影响，特别是细胞内过程。为此，研讨了 17 天的补料分批 CHO 培育。经过运用 0.2 × 10 6 cells/mL 的相似接种细胞密度、相同的规范培育条件（36.5°C、pH 7.15、DO 为 40% 空气饱和度）和相似的补液战略，确保了不同范围之间的分歧性。丈量了蛋白质组的时间演化，并经过数据发掘措施（例如层次聚类和对单个蛋白质的细致剖析）考证了范围之间简直绝对的分歧性。固然相似的细胞密度曲线、生长速率和特定的消费和耗费速率被丈量为与反响器范围无关的时间函数，但察看到与 N-糖基化相关的主要酶的微小差别招致聚糖方式略有不同。这可能是由于 ambr 15 和 300 L 中试范围在几何外形、剪切速率、混合和氧气传质方式方面的差别构成的。Villiger等人（2018）察看到，ambr 系统中大部分区域混合不良，其可能在这里产生重要影响。但是，应该提到的是，察看到的差别对聚糖散布的影响很小，并且在两种反响器中察看到了高度可比的总体工艺性能，从而证明了放大程序的牢靠性。

Karst等人（2016）报道了灌流生物反响器相当完好的表征 - 就流体动力剪切速率、k L a 和混合时间方面 - 旨在研讨框架中比较 ATF 和 TFF 截留装置。ATF 泵以 1-1.5 L/min 的给定流速定期置换 100 mL。如第 2 章所述，TFF 装置由衔接到中空纤维的无轴承离心泵驱动。反响器系统是一个 2.5 L 的台式范围生物反响器，直径为 13 cm (T)。在 TFF 系统的状况下，玻璃容器被修正为底部出口，以使无轴承泵能够直接衔接，使细胞培育经过外部回路循环。运用直径 D 为 4.5 cm 的六叶片Rushton 涡轮叶轮，并在叶轮下方 1 cm 处装置一个启齿为 1 mm 的四全开管式鼓泡，以为细胞提供所需量的氧气。工作体积设置为 1.5 L。作者评价了给定设置的传质系数与不同搅拌速度 (300–500 rpm)和通气速率(0.11 – 0.33 vvm) 下单位功率输入和表观气体速度的关系。

图5.7 在2 L生物反响器中丈量的最大流体动力应力：(a) 与叶轮雷诺数 (Re imp )的关系 ，无细胞过滤和无鼓泡；(B) 存在ATF（实心方格）和TFF（空心方格）细胞截留装置时，与过滤器中循环流速的关系，鼓泡通气速率为0.22 vvm，搅拌速度为400 rpm。水平虚线表示所思索的CHO细胞系的临界剪应力值为32 Pa。

关于给定的生物反响器配置，肯定了 5 – 40 h -1 范围内的 k L a 值，这足以支持高达 10 8 cells/mL的密度。运用阅历相关性，依据基于操作搅拌器轴的电机吸收的功率计算的功率数估量混合时间。所思索的一切条件下取得的值都在 2-6 秒的范围内，这足够快，以避免系统中的不平均性。最后，运用上述剪切敏感 PMMA颗粒系统估量系统内的有效最大流体动力应力。已知所用细胞系的最大可耐受应力约为 32 Pa。Karst 等人(2016a) 评价了过滤组件对最大流体动力应力的贡献。如图 5.7A 所示，在没有过滤组件和通气的状况下，在 500 rpm 下测得的最大剪切应力为 37 Pa（大于细胞接受的剪切应力）。此外，思索到细胞截留系统，最大剪切应力值是在0.22 vvm 的通气速率下丈量的，搅拌速度为 400 rpm，与 ATF 或 TFF 截留装置中循环流速相关，如图5.7B 所示。发往常相当的流速下，与 TFF 系统相比，ATF 中细胞在培育过程中所接受的流体动力应力较小，并且由此产生的最大流体动力应力低于给定细胞系的讲演阈值。因而，能够预期整个操作范围内的保险培育。经过比较两种设置中的细胞培育性能，察看到相似的培育性能和产质量量。但是，就产物截留而言，与 ATF 相比，运用 TFF 会招致相当大的蛋白质截留。

图 5.8 基于 CHO (A) 和Sp2/0 (B) 细胞系在培育的前 24 小时内活性降落的临界应力肯定示例（虚线箭头）。灌流工艺牢靠放大的关键表征：（1）肯定细胞特异性最大可接受动态应力和（2）反响器系统在单位体积气-液传质速率 k L a、混合特征时间 θm 和最大剪切率 τmax方面的计算和实验表征。

从这项研讨的结果能够分明地看出，恰当的反响器表征关于工艺设计和范围放大至关重要，特别是在剪切应力方面。细胞截留装置为反响器系统中存在的剪切应力带来了额外的贡献。Wang等人(2017) 发现，与ATF 系统或无轴承离心泵驱动的 TFF 系统相比，由爬动泵驱动的 TFF 系统的剪切率显著进步，从而招致更高水平的细胞死亡和产物截留。关于放大，目前还没有商业范围的灌流生物反响器的表征研讨，但运用本章描画的措施，绝对有可能确保牢靠地放大到商业化范围。

图 5.8 以图形方式总结了牢靠范围放大的关键步骤，包含初步肯定给定细胞系的最大可耐受流体动力应力，然后依据相间传质、混合和最大剪切率对不同范围的生物反响器中止物理表征。

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原文：Perfusion Cell Culture Processes for Biopharmaceuticals Process Development, Design, and Scale-up , pp. 100 - 137