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蛋白纯化的应战是显而易见的，鉴于表白宿主中存在复杂的生物大分子混合物，通常需求中止重组蛋白的提取。随着新一代色谱介质和自动化系统的呈现，过去研讨人员需求破费几个月时间来树立一个蛋白纯化操作流程的日子曾经一去不复返了。但是，并不是一切的问题都能够用复杂的色谱柱填料和实验室设备来处置。在寻觅样本预处置的最佳条件，选择适合的缓冲条件，或处置蛋白质的不溶性时仍存在艰难。 在开端纯化蛋白质之前，我们应首先了解所纯化蛋白质的用处、纯度、所需的浓度以及贮存条件。在设计和肯定一个经济、省时且能中止大量目的蛋白纯化的计划时，一切要素都是至关重要的。
图1 纯化过程初始设计时重要的理化参数 蛋白质的原料 固然从蛋白质的自然来源中中止蛋白纯化是相对常见的，但随着近年来基因操作和重组表白范畴的不时展开，可完成对目的蛋白中止过表白，现有的过表白系统包含大肠、酵母、昆虫及哺乳细胞。每种宿主表白系统都有各自的优势和缺乏。例如，E. coli系统具有最高的表白量，普通的平均产量有2.5 g/L，但是它缺乏任何的翻译后修饰。另外，假如蛋白需求糖基化，那么相较于昆虫和哺乳细胞，酵母系统能够提供大量的糖基化修饰。表白系统的选择依赖于蛋白自身的特性以及它的下游应用。 提取措施 大多数状况下，提取过程取决于蛋白质的来源，它可能是细菌、酵母或哺乳动物细胞，也可能是胞内/胞外。从细胞内提取蛋白常常面临着回收率和纯度低的问题。提取的主要目的应该是取得不降解或不变性的的所需蛋白质，且污染物极少以至没有。 通常对提取培育基、时间、温度、裂解设备及能量输入（搅拌速度、压力等）等参数中止战略性改动来优化提取计划。需求留意的是，措施的选择应该是尽可能温和的，由于过于猛烈或苛刻的条件可能会使所需求的蛋白质变性或释放内蛋白水解酶，并惹起普遍的酸化。提取过程中无法逃避的主要问题之一是蛋白水解或核酸污染。但是，经过在提取培育基中参与核酸酶或蛋白抑止剂，且在低温环境下操作可在某些水平上避免蛋白水解和核酸污染。因而，关于优化设计来说，为了使蛋白质的含量和活性最大化，在小范围内规范化初步实验是十分必要的，之后能够有效放大。 提取试剂的组成应该能使蛋白坚持稳定，并以最大的回收率和纯度使蛋白从细胞中有效释放出来。当在制备提取试剂或裂解缓冲液时应思索下述要素：缓冲液盐浓度、pH、恢复剂、变性剂、去污剂、金属离子、蛋白酶抑止剂和DNA酶。 溶解度和纯化战略设计 蛋白的溶解度 在任何蛋白的纯化中，蛋白溶解度都是一个关键参数。不同蛋白间的溶解度明显不同，其高度依赖于蛋白的物理化学特性及其所处的溶剂。很大水平影响蛋白溶解度的参数包含溶剂的pH、离子强度、温度，以及蛋白名义裸露的氨基酸侧链类型。在溶剂中带有电荷较少的蛋白和含有疏水氨基酸的蛋白通常是难溶的。由于很难精确预测蛋白的溶解特性，我们应该经过改动不同的条件，并分离表明不同条件下蛋白溶解度的SDS-PAGE实验结果，认真设计蛋白的初步研讨。 盐析 盐析，通常被称为盐诱导的沉淀或盐分馏法，其主要基于蛋白与盐的相互作用。盐倾向于在水溶液（溶剂）中解离合成，这是盐析过程发作的基础。当盐浓度升高，盐离子逐步与水分子分离，同时招致与蛋白带电部分分离的水分子数量减少。最终，由于蛋白间的相互作用强于蛋白与溶剂的相互作用，所以蛋白质分子间趋向于相互作用，从而招致蛋白质汇集和随后的沉淀。这个过程称为盐析（图2）。重要的是，不同蛋白经过盐析中止蛋白沉淀时所需的盐浓度是不一样的。硫酸铵是中止蛋白沉淀最常用的盐之一。
图2 蛋白质溶解度与盐浓度的关系。蛋白质随盐浓度变更的二维溶解度曲线表示图。溶解曲线将平面划分为两个区域—盐溶（绿色）和盐析（粉色）。 盐溶 蛋白溶解度受溶液中离子强度的影响。假如把蛋白质放在像水一样的水溶液中，那么溶液中独一的离子成分就是蛋白质分子。固然水是极性的，但它只会细微电离，因而蛋白质由于蛋白分子间的离子相互作用而趋向汇集。相比于蛋白质-水间的相互作用，蛋白-蛋白间的相互作用更易招致不可逆的汇集。NaCl等盐离子浓度较低时，其他离子的呈现能够与离子的蛋白间相互作用产生竞争。溶液中的这些离子常常维护蛋白分子不受其他蛋白分子的电荷影响。蛋白分子间静电作用的削弱，最终增加了蛋白的溶解度，被称之为“盐溶”。但是，当离子强度开端变得过高时，它会对蛋白的溶解度产生负面影响，招致“盐析”。 蛋白的盐溶通常发作在其等电点（pI）左近。除了静电效应外，蛋白名义有限的电荷也会影响与蛋白相关的水分子。总而言之，盐离子与蛋白分子的电荷基团分离增加了蛋白的溶解度，从而招致蛋白的“盐溶”。 包涵体蛋白的处置 在E.coli中中止重组蛋白的大量表白时常常会构成不可溶的和汇集的蛋白，这些蛋白被称为“包涵体”。除了不可溶之外，包涵体也没有蛋白的自然构象，因而，这就请求对包涵体中止溶解处置和重折叠，以使目的蛋白具有自然构象。这通常需求大量的优化，而且十分耗时。此外，在蛋白重折叠过程中，蛋白量可能会呈现明显的损失。经过改动蛋白表白中的几个条件来避免E.coli中包涵体的构成。在多数状况下，常常经过低温（如18℃）和低于0.5 mM IPTG（异丙基硫半乳糖苷）诱导表白来处置包涵体构成的问题。 关于包涵体的分别，搜集表白目的蛋白的细胞，机械裂解，然后在4℃条件下高速（20000 g）离心15 min。离心取得的沉淀即为包涵体。然后用去污剂对沉淀中止洗濯，如1% Triton-X，随后用8 M尿素或6 M盐酸胍等化学变性剂对蛋白中止变性处置。变性步骤可重复多次直至取得最大回收率。包涵体经过这些步骤处置后常常有大于90%的纯度。若目的蛋白中含有杂质，能够中止亲和层析纯化或盐析沉淀以增加它的纯度。经过稀释或透析的方式逐步移除变性剂，使变性后的蛋白中止重折叠。 变性蛋白在重折叠过程中的一些关键参数包含温度、pH、恢复剂（如DTT、TCEP）和添加剂（常常分离运用）。但是，关于胜利的重折叠来说，更重要的是要中止多次条件探求和后续的条件优化。蛋白重折叠的胜利率常常是不尽如人意的。因而，需求测试大量的重折叠条件，以便取得大量高纯度且具有生物活性的蛋白质。除了稀释或透析措施外，未折叠蛋白溶液中的变性剂也能够用不同的层析技术去除。 层析法的概述 柱层析，通常运用液相色谱法（LC）中止重组蛋白的纯化。层析法中，固定相被填充在层析柱上，应用泵或重力流使得液体活动相经过层析柱。样品混合物在层析柱的一端引入，随着活动相在层析柱的另一端被洗脱下来。混合物中各组分的分别取决于分子在固定相和活动相之间的分配，而这主要是基于它们分子量的差别。为了目的蛋白取得令人称心的纯度和均一性，通常运用亲和层析、离子交流层析，以及体积排阻色谱等技术对重组蛋白中止纯化。 亲和层析 有基于亲和的多种措施被用于纯化重组蛋白。基于亲和纯化的常用战略是融合标签（例如，添加在重组蛋白上的氨基酸序列）的运用，标签对固定在层析柱上的配体有亲和性。表1罗列了一些常用的标签。 表1 用于重组蛋白纯化的常用融合标签
注：AC：亲和层析，IEX：离子交流层析，a.a.：氨基酸，kDa：千道尔顿 特别是，组氨酸（His）标签（由6个或更多组氨酸残基构成的多肽序列）能够添加在重组蛋白的N端或C端，其通常用于从细胞裂解取得的蛋白混合物中纯化目的蛋白。His标签标记的蛋白对二价金属离子（如Ni +2 或Zn +2 ）具有亲和性，因而，这种层析技术又称为固定化金属亲和层析（IMAC）。IMAC系统的主要优势是它能接受普遍的缓冲条件，包含去污剂和化学变性剂等添加剂的存在。此外，树脂能够再生，并且能够重复运用几次，因而，能够使学术界和工业界展开经济的纯化战略。图3提供了Ni-NTA亲和层析的表示图。
图3 运用Ni-NTA亲和层析纯化多His标记蛋白的表示图 多聚组氨酸标签最主要的缺陷之一是蛋白和IMAC柱的非特异性分离。但是，由于分子量很小，所以His标签也有一些优势，好比它简直不会影响蛋白功用。大多数状况下，仅一步纯化即可将蛋白纯度提升至90-95%。IMAC树脂不受细胞裂解产物中蛋白酶和核酸酶的影响，这使得它适用于粗提取物的纯化。His标签的优势之一是它可与其他亲和标签（见表1）分离运用，完成对同一蛋白的标记，为纯化过程提供了很灵活的选择空间。总之，相较于基于亲和的其他纯化措施，IMAC是一种快速且低价的纯化措施。 与多聚组氨酸标签相似，其他可选择的亲和标签，如MBP或GST也被频繁运用；但是，由于这些标签的分子量较大，可经过在标签和目的蛋白间引入特定的酶切位点，以便在后续的处置中将标签去除。由于大标签触及额外的处置步骤，因而这些大标签的运用增加了纯化重组蛋白的后续处置成本。 离子交流层析（IEX） IEX是基于蛋白带电基团与柱基质间的静电相互作用。IEX中蛋白的分别取决于蛋白名义的电荷、活动相的pH和盐浓度。IEX普遍应用于未带标签重组蛋白的纯化。蛋白质与层析柱的分离依赖于蛋白质名义电荷和柱基质所带电荷间的相互作用（图4a）。这种相互作用是可逆的，能够经过盐的线性梯度或改动pH来破坏这种作用，从而使层析柱上分离的蛋白被洗脱下来。 在温和的条件下，IEX为重组蛋白提供高的分离才干和分别分辨率。另外，由于IEX具有可放大（特别是对重组蛋白），价钱适中，普遍的适用性等优点，已使IEX成为应用最普遍、用处最普遍的液相色谱技术之一。
图4 离子交流层析的表示图 (a)阴离子和阳离子交流剂分别与带负电荷和正电荷的分子分离。(b)阴离子交流层析流程图。 体积排阻色谱 体积排阻色谱（SEC），也被称为凝胶过滤层析，依据其流体动力学体积和分子量的差别分别大分子。固定相由惰性球状珠或具有特定孔径的凝胶组成。比凝胶孔径大的蛋白不能渗入到凝胶颗粒中，经过珠子间的空隙首先被洗脱下来。另一方面，比凝胶孔径小的蛋白扩散到孔隙中，洗脱时间按比例延长（即从蛋白进入到孔隙至蛋白检出所破费的时间。因而，SEC也被普遍称为凝胶过滤层析。SEC中，蛋白分子不直接与活动相发作作用，因而，缓冲液的成分不影响色谱柱的分辨率（即峰的分别水平）。相比小蛋白，大蛋白的保存时间要短，这得以完成蛋白分别。除了凝胶孔径大小外，层析柱的分辨率也受柱床高度、流速、样本体积及蛋白分子量的影响。通常来说，当流速控制在慢速至中速，层析柱长且窄，凝胶孔径小及样本体积小（占层析柱总体积的1-5%）时有可能取得最高的分辨率。体积排阻色谱的总设计如图5所示。由于SEC具有良好的脱盐性能，因而它被普遍应用于重组蛋白纯化中最后的精制步骤。
图5 体积排阻色谱（SEC）的表示图 结论 重组蛋白消费的瓶颈是蛋白纯化的成本。因而，在过去的几十年里，研讨者们为改进现有战略和展开新的纯化措施做出了极大努力。这里，我们引见了细菌系统表白的重组蛋白的普通纯化步骤，如E.coli，它是蛋白表白最首选的微生物细胞工厂之一。但E.coli系统合适稳定表白折叠的球状蛋白，对膜蛋白或膜相关蛋白的表白和纯化来说常常是艰难的。我们引见了E.coli中表白和纯化重组蛋白时遇见应战的可能途径。固然这些概述的措施中的很多种可能会在不同阶段中失败，但由于重组蛋白的表白和纯化常常是蛋白特异性的，因而必须找到措施来规范化操作，且中止普遍的毛病扫除来抑止这些艰难。 原文来源：摘译自Textbook on Cloning, Expression and Purification of Recombinant，Chapter 5 重组蛋白专题：蛋白质的定量测定 重组蛋白专题——凝胶过滤色谱技术 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研讨方向！ 版 权 声 明 本公众号一切转载文章系出于传送更多信息之目的，且明白注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联络(cbplib@163.com)，我们将立刻中止删除处置。一切文章仅代表作者观念，不代表本站立场。 |
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