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（本文约5000字，估量阅读15分钟） ▼ 世界卫生组织（WHO）统计显现，截至3月13日，全球共有41个候选疫苗在研发。另外一组统计数据是，截至3月17日，全球至少有96家公司和学术团体宣布66个新冠病毒疫苗开发计划 [1] 。 据国度卫健委医药卫生科技展开研讨中心引见，目前国内新冠疫苗攻关工作正沿着5条技术道路推进，即：灭活疫苗、重组亚单位疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体疫苗、核酸疫苗 [2] 。 本文拟引见这5种新冠疫苗技术道路的原理、研讨停顿、特性及其消费工艺。 01 研发中的新冠疫苗 1. 灭活疫苗 灭活疫苗是指将病毒经恰当的措施中止批量培育并灭活处置之后制备而成的疫苗 [3] 。病毒灭活疫苗是一种经典的疫苗方式，也是一种易于快速研讨和制备的有效疫苗。通常在发作病毒性传染病时，常常优先选择针对该病毒的灭活疫苗。 在曾经上市的疫苗中，以灭活疫苗居多，例如狂犬病灭活疫苗、流感灭活疫苗、肠道病毒71型灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗等 [3][4] 。 据报道，国内有多家公司和机构研发新型冠状病毒的灭活疫苗，见表1。 表1 研发新型冠状病毒的灭活疫苗的单位 （来源于公开信息）
灭活疫苗的 优点是： （1）相关于减毒活疫苗，保险性好； （2）相关于亚单位疫苗，具有完好的分子空间结构，抗原成分的空间结构比较接近原始状态； （3）相关于减毒活疫苗，易于贮存和运输。 灭活疫苗的 缺陷有： （1）相关于减毒活疫苗，产生免疫力需求长时间； （2）相关于减毒活疫苗，接种途径少； （3）相关于亚单位疫苗，反作用较大； （4）相关于亚单位疫苗，批间差控制难度稍大。 2. 重组亚单位疫苗与多肽疫苗 重组亚单位疫苗主要是经过基因工程表白的蛋白抗原纯化后制成的疫苗，以及将抗原组装成病毒颗粒样（VLP），从而构成VLP疫苗。基因工程表白的抗原岂但能够替代传统的措施消费抗原，而且还能够用于病原体难于培育或有潜在致癌性，或免疫病理作用的疫苗。 多肽疫苗是依照病原体抗原基因中已知或预测的某段抗原表位的氨基酸序列，经过合成技术制备的疫苗 [3] 。 随着生物技术特别是结构生物学的展开，经过结构改造设计疫苗的报道如雨后春笋般涌现。好比，将病原体的含抗原决议部位的蛋白嫁接到骨架上或者固定成特定目的结构，从而惹起机体中和抗体的产生 [9][10] 。 曾经上市的亚单位疫苗产品有重组带状疱疹疫苗、基因工程乙型肝炎疫苗、基因工程人乳头瘤疫苗、基因工程戊型肝炎疫苗等[3]。 据报道，国内曾经有多家公司和机构启动新冠病毒重组亚单位疫苗的研讨，如中科院微生物研讨所、智飞生物、宇之波生物、昭衍生物、神州细胞[7] [11] 等。上海在新闻发布会上透露某公司制备的病毒样颗粒（VLP）疫苗的小鼠免疫实验已产生特异性抗体[12] 。北京康乐卫士将新冠病毒的最有效的抗原成份（表位）基因拿出来，插入到其它病毒的结构蛋白基因中，中止体外重组和融合蛋白表白，制成多肽疫苗，正在动物体内中止测试[13] 。 康众生物采用一种创新的人工合成病毒样颗粒（Synthetic Virus-like Particles, SVLP）核酸递送技术，制备重组蛋白疫苗佐剂，模仿病毒的自然结构及自然感染过程，具有快速诱导机体产生极强的体液免疫和细胞免疫应对的优势。动物实验结果表明，免疫后7天即可取得足够高的S1抗体效价，三周后抗体平均效价达1:600万以上，实验动物对疫苗制剂耐受良好[14] 。 值得留意的是三叶草生物制药公司在哺乳动物细胞内胜利表白“S-三聚体”新型冠状病毒重组蛋白疫苗。用新取得的“S-三聚体”抗原在多例病毒感染患者康复后血清中检测到病毒特异性抗体。这一结果表明“S-三聚体”重组疫苗保存了新冠病毒S-蛋白抗原自然的结构，因而“S-三聚体”疫苗有望在人体中诱导维护性的免疫反响[15] 。 表2 研发新型冠状病毒重组蛋白疫苗的单位 （来源于公开信息）
亚单位疫苗与多肽疫苗 优点是： （1） 产量大、纯度高； （2） 反作用小； （3） 保险性高，针对性强； （4） 一定水平上能够避免抗体依赖性增强效应 （ antibody-dependent enhancement, ADE）。 亚单位疫苗与多肽疫苗 缺陷有： （1） 成本较高； （2） 依赖佐剂以至受佐剂限制。 3. 载体疫苗 载体疫苗是指应用微生物，如某些细菌和病毒做载体，将维护性抗原重组到微生物中，运用能表白维护性抗原基因的重组微生物制成的疫苗。常见的病毒载体有痘苗病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒、甲病毒复制子等 [3] 。 曾经上市的载体疫苗有重组埃博拉病毒疫苗（腺病毒载体） [16] 。 由康希诺联手军事科学院军事医学研讨院生物工程研讨所研发的重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)曾经处于临床阶段[17]。另外，杨森生物、武汉博沃等单位也正在研发病毒载体新冠疫苗 [11][18] 。 值得关注的是，厦门大学和长春百克生物等单位分离研发的减毒流感病毒载体新冠疫苗也在研发中，该类疫苗能够经过鼻腔滴注方式接种 [19] ，假如研制 胜利有利于进步疫苗接种率。该流感病毒载体疫苗正在中止实验动物的保险性和有效性研讨，估量4月底完成候选疫苗的临床前研讨[20] 。 表3 研发新型冠状病毒载体疫苗的单位 （来源于公开信息）
载体疫苗 优点是： （1） 无需佐剂，载体自身可发挥佐剂作用； （2） 诱导体液免疫和细胞免疫，以至粘膜免疫； （3） 纯化简单； （4） 能够同时表白多个抗原做分离疫苗。 载体疫苗 缺陷有： （1） 机体中和抗体中和； （2） 有一定的保险隐患。 4. 核酸疫苗 核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并经过宿主细胞的表白系统合成抗原蛋白，诱导机体产生对该抗原蛋白的免疫应对，以抵达预防和治疗疾病的目的 [3] 。 核酸疫苗普通分为DNA疫苗和mRNA疫苗两种。相比前面几种疫苗，核酸疫苗消费工艺相对简单 [21] ，特别是mRNA疫苗无需细胞培育或动物源基质、合成速度快、成本低。mRNA疫苗发挥作用无需进入细胞核，没有整合至宿主基因组的风险，且为一过性表白，半衰期能够经过修饰中止调整。因而，mRNA疫苗的展开前景比较明朗 [22] 。 目前上市的核酸疫苗主要是DNA疫苗，且都为兽用疫苗，如西尼罗病DNA疫苗（马用）、犬黑色素瘤DNA疫苗 [3] ；国内有预防H5亚型禽流感的DNA疫苗 [23] 。值得关注的是很多mRNA疫苗产品曾经进入临床阶段。好比，BioNTech针对黑色素瘤个性化肿瘤疫苗在II期临床，前列腺癌、乳腺癌等的mRNA疫苗在I期临床中；CureVac针对非小细胞肺癌、黑色素瘤的mRNA疫苗在I期临床；Moderna针对黑色素瘤的mRNA疫苗曾经展开II期临床；Tuebingen大学针对黑色素瘤的mRNA疫苗曾经完成I/II期临床 [22] 。 美国生物科技公司Moderna的新冠病毒mRNA实验性疫苗，跳过动物实验， 直接开端人体实验[24] 。德国CureVac公司日前也已宣布，将尽快且保险地将候选mRNA疫苗推进临床实验[25] 。 在国内，Inovio&艾棣维欣&康泰生物正在研发DNA疫苗；冠昊生物& ZYTherapeuticsInc、中国疾病预防控制中心&上海同济大学医学院&上海生物技术公司斯微生物等正在研发mRNA疫苗 [11][18] 。 表4 研发新型冠状病毒核酸疫苗的单位 （来源于公开信息）
核酸疫苗的 优点是 （1） 工艺简单、成本低； （2） 无需佐剂； （3） 可对肿瘤疾病发挥作用； （4） DNA疫苗自带佐剂功用； （5） mRNA疫苗研发、消费时间短，易于放大； （6） mRNA疫苗特别合适突发性传染病。 核酸疫苗 缺陷有： （1） DNA有整合宿主基因组的风险； （2） RNA容易降解。 （3） mRNA疫苗需求修饰和递送系统。 此外，还有一些新技术和优势平台也在参与或助力新冠病毒疫苗研讨。 北京鼎成肽源生物与贝达药业协作，针对新冠病毒研发的抗新冠病毒通用型细胞疫苗已进入动物实验阶段，估量4月下旬中止临床研讨 [26] 。 澳大利亚昆士兰大学正应用一种“分子钳”技术能够增加病毒蛋白的稳定性。研讨人员尝试应用该技术开发针对埃博拉病毒、流感病毒等疫苗，已取得十分理想的实验效果。该校研讨团队目前已取得新冠病毒的基因序列，正处于研制疫苗的初期阶段。 英国葛兰素史克（GSK）公司将与国际组织“盛行病防备创新联盟”协作，推进新冠病毒疫苗的全球研发。该公司的优势技术之一，就是关于疫苗消费十 分重要的佐剂[24] 。 02 新冠疫苗有关的消费工艺 1. 病毒类疫苗 病毒类疫苗主要包含减毒活疫苗、灭活疫苗，以及病毒载体疫苗（以病毒为载体的活疫苗），这些类型的疫苗消费工艺相似。相对来说，灭活疫苗主要是多了灭活的步骤，需求更大的消费范围，同时下游纯化也稍微复杂，制剂需求佐剂增强抗原的免疫作用。而减毒活疫苗和病毒载体疫苗消费范围相对较小，下游纯化简单，普通无需佐剂。 病毒培育历经动物器官培育、禽胚培育，到往常大部分应用细胞培育，包含原代细胞和传代细胞。原代细胞无转化性质，但容易产生批间差，而且容易污染。传代细胞批间差别小，有利于大范围培育，但具有转化性质。往常大部分疫苗采用传代细胞中止大范围培育。 人用病毒疫苗消费常用的细胞有Vero细胞、人二倍体细胞等，多为贴壁细胞，运用细胞工厂培育或运用微载体在生物反响器中培育，在培育基中添加牛血清的细胞培育方式。 病毒载体疫苗消费常用HEK293细胞来扩增载体病毒，由于部分载体病毒对血清敏感，大多采用无血清培育方式。还有一些制备载体疫苗的病毒载体是运用禽胚中止培育的。 细胞培育制备病毒培育物经过破碎、过滤后称为病毒原液。关于灭活疫苗在病毒灭活以后需求进一步纯化，以至还需浓缩病毒。然后配制如稀释或参与佐剂。
图1. 病毒类疫苗消费工艺表示图 图1是病毒类疫苗消费工艺表示，研发中的新冠灭活疫苗和病毒载体疫苗基本都采用相似消费工艺消费，但减毒流感病毒载体新冠疫苗可能例外。 国内流感病毒疫苗采用鸡胚病毒扩增的消费工艺，固然国内曾经有MDCK细胞培育工艺的禽用禽流感疫苗上市，但人用流感疫苗还不时运用鸡胚消费工艺。国外流感疫苗消费工艺有鸡胚扩增病毒扩增工艺，也有细胞培育工艺，包含Vero 细胞、MDCK细胞、EB66细胞等。 2. 重组蛋白类疫苗 重组蛋白类疫苗主要有重组亚单位疫苗、VLP疫苗等，表白系统有大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞，应依据蛋白抗原的特性选择表白系统。 大肠杆菌表白会触及包涵体变性复性，但培育基请求简单。 酵母菌表白重组蛋白中运用较多的是毕赤酵母、酿酒酵母、汉逊酵母等 ，培育基请求也不复杂。 昆虫细胞培育杆状病毒表白常用的昆虫细胞有Sf9细胞、Sf21细胞等，采用无血清培育基在生物反响器中培育。 制备重组蛋白疫苗常用的哺乳动物细胞HEK293、CHO等，采用无血清培育基在生物反响器中培育。 表5 不同表白系统的优势和优势
不同表白系统的下游纯化方面差别很大，应该依据表白蛋白特性选择纯化工艺。
图2. 重组蛋白类疫苗消费工艺表示图 图2是重组蛋白类疫苗消费工艺表示，研发中的重组亚单位新冠疫苗和病毒颗粒样（VLP）疫苗普通采用相似消费工艺消费。 3. 核酸类疫苗 核酸类疫苗包含DNA疫苗和mRNA疫苗。 DNA疫苗消费工艺相对简单，其中工程菌的发酵和纯化是影响DNA疫苗产量和消费成本的两个关键环节 [21] 。
图3.DNA疫苗消费工艺表示图 图3是DNA疫苗消费工艺表示，研发中的DNA新冠疫苗普通采用相似消费工艺消费。 mRNA疫苗产业化容易，速度快，成本低，从基因测序至消费只需求数周的时间，因而在对时间请求比较紧急的疫情中有望发挥重要作用。
图4. mRNA疫苗消费工艺表示图 图4是mRNA疫苗消费工艺表示，研发中的mRNA新冠疫苗普通采用相似消费工艺消费。 面对新冠疫情，全球疫苗公司八仙过海、各显神通，基于自己公司的平台研发新冠疫苗。停顿较快的是美国Moderna的新冠病毒mRNA疫苗和国内康希诺腺病毒载体疫苗，均曾经进入临床阶段 [17][24] 。但疫苗的研发需求较长的过程。第一个阶段是疫苗前期研发过程，包含取得免疫原、免疫反响测试、动物维护测试、消费工艺优化、临床前毒理研讨等环节；第二个阶段是疫苗研发及注册过程，包含临床前研讨、申报临床、完成临床实验，最后才干完成疫苗上市 [27] 。 到底哪些疫苗能够杀出重围，造福人类，让我们拭目以待！ （2020年3月29日） 参考资料 [3]赵铠. 疫苗研讨与应用[M].人民卫生出版社，2013 [4]https://vaccines.procon.org/view.resource.php?resourceID=005206 [5]https://www.cnbg.com.cn/content/details_12_5017.html [8]https://mp.weixin.qq.com/s/NFDe0pWrRMDpL7T2zGge6g [10]Zhang B , Chen L , SilacciC , et al. Protection of calves by a prefusion-stabilized bovine RSV Fvaccine[J]. npj Vaccines, 2017, 2(1):7. [12]http://dy.163.com/v2/article/detail/F7SQGCM30537A5Y9.html [14]http://www.sysvax.com/show-201.html [16]http://www.uux.cn/viewnews-87197.html [18]http://zhengce.chinabaogao.com/yiyao/2020/0394RE92020.html [21]陈光明,刘玉华. 核酸疫苗制备工艺研讨停顿[J]. 生物技术通讯, 2006(06):129-131. [22]http://finance.ifeng.com/c/7v2p2iv1Bzd [25]https://c.m.163.com/news/a/F5GNEG6J00018AOQ.html?spss=wap_refluxdl_2018&spssid=57bb9a8658d39b2db9ba6b3ea54bd32a&spsw=1&isFromH5Share=article 来源：生物咖啡茶 |
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