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疫苗的保险性请求十分高，由于它们是用于健康人的。因而，疫苗开发既耗时又十分昂贵。 缩短上市时间关于制药公司来说是关键，能够挽救生命，并俭省金钱。因而，需求系统的、通用的和有效的工艺开发战略来缩短开发时间并增强对工艺的了解。高通量技术极大地增加了与工艺相关的有用数据量，分离统计和机械建模，新的高通量工艺开发(HTPD) 措施不时展开。引入基于模型的 HTPD 能够更快、更普遍地选择条件，并进一步增加学问。基于模型的 HTPD 关于层析法特别重要，然后者是取得高纯度的关键分别技术。 本综述将引见生物制药行业中运用的下游工艺开发战略和工具，重点关注疫苗纯化工艺。随后将依据实验工作和了解，对高通量工艺开发和其它组合措施中止讨论和比较。在不时增长的信息海洋中，新型建模工具和人工智能(AI) 关于发现数据背地的方式并因而取得更深化的工艺了解变得越来越重要。 下游工艺开发措施 工艺开发的总体目的是设计最佳的纯化工艺，经过以最小的成本和时间，努力完成纯度目的，同时恪守一切法规请求。目前，疫苗开发主要采用基于DoE 的措施，但它也能够受益于更先进的、基于模型的工艺开发措施，这些措施曾经用于其它生物制药范畴，例如mAb 的纯化。图 3 显现了两种类型的工艺开发措施，基于 DoE 的措施和基于建模的措施。在下文中，将扼要引见工艺开发措施。
图3. 两种不同工艺开发措施概述。左:实验设计(DoE)措施，基于统计工具中止实验，并经过统计剖析评价结果。这种措施通常应用于生物制药行业。右:基于模型的工艺开发措施，经过有针对性的实验肯定模型输入参数，如等温线参数和柱参数。在执行优化之前，必须对模型中止考证。 实验驱动的下游工艺开发 一次一个要素（OFAT）和实验设计（DOE） 一次一个要素 (OFAT) 是一种更传统的措施，其中一个要素在一系列实验期间发作变更，而其它要素坚持不变。在这种措施中，要素之间的依赖关系被疏忽了，因而发现最优值相当艰难且效率很低。出于这个缘由，十多年前，生物制药行业转向基于统计的DoE 措施来设计和剖析实验，从而经过减少实验取得更多有价值的信息。经典的DoE 措施是因子设计。对一切可能的要素组合中止实验，目的是肯定每个要素的影响以及要素之间的相互作用对响应的影响。对经典DoE 选择的改进是肯定性选择设计，它估量曲率效应并能够将对响应具有显著影响的要素与具有可疏忽不计影响的要素分辨开来。提供三级多要素设计的其它措施是Box-Behnken 或中心复合设计。Hibbert D.B.深化引见了最常用的 DoE 措施，重点是层析。往常有各种DoE 软件，如 Design-Expert、Modde 和JMP，但其它统计软件，如 R、SPSS 和各种Python 软件包，也可用于 DoE 目的。 针对建模目的的数据获取 另一种实验战略是肯定作为机械或物理模型输入的参数。机械模型的运用已在几十年前树立，往常已被化学工业普遍采用，其中一些工艺以至完整在计算机上设计。直到最近，生物制药和疫苗行业才在其工艺开发中启动了这一战略，其中主要应战通常是复杂的进样混合物，其中包含目的产品（例如抗原）以及数千种蛋白质和杂质。这可能就是为什么机械建模和参数采集尚未被普遍采用的缘由，由于简直不可能经过实验肯定和模仿数千种蛋白质和杂质。但是，HTE使肯定模型参数十分值得，即便关于更复杂的混合物。值得留意的是，经过考证的模型增加了对工艺的了解，并能够优化计算机中的工艺，从而俭省时间、资料和成本。关于层析目的，由于这是蛋白质亚单位疫苗中的主要纯化技术，描画组分与固相分离行为的吸附等温线参数至关重要。吸附均衡的实验测定是树立等温线参数所必须的，能够经过批量吸附实验、正面剖析、等度洗脱或线性梯度洗脱或应用逆技术获取，经过调整某些参数来最小化实验和模仿洗脱曲线之间的差别。除了等温线测定外，还必须取得层析柱和填料的特性才干取得经过考证的模型，但是这些更容易取得。 高通量选择 大约二十年前，液体处置站 (LHS) 的引入加速了实验的执行，也称为高通量实验（THE） 或高通量选择（HTS）。由于自动化、微型化和并行化，创建大型数据集变得可行，同时允许更短的时间内运用更少的样本量和资源。自动化的另一个益处是降低了可变性，并提供杰出的精度。往常，LHS已成为学术界和工业界普遍应用的技术，可显著缩短工艺开发时间。由于LHS 允许选择更多条件，因而为纯化工艺找到最佳条件更为可行。除了系统的益处之外，文献也报道了一些缺陷。例如，LHS在精确模仿工艺柱的液流散布方面存在局限性。HTS 需求对有效的实验设计有高度的了解，以便最佳天时用系统，因而它更像是一种工具，而不是一种单独的措施。 专业学问驱动的下游工艺开发 普通阅历 阅历规律、现有工艺的可用学问和阅历是设计新消费工艺的专业学问或启示式措施的基础。专业见解很容易应用，并且能够经过消弭结果不太理想的单元操作的组合来加速工艺设计。Asenjo等人开发了一个专注于下游蛋白质工艺的专业系统；该软件运用由通用工艺设计（启示式）专业学问组成的数据库来支持和加速选择一系列单元操作的决策。一些手册也普遍地概述了普通设计启示式。大多数疫苗纯化工艺也基于启示式措施，例如从哺乳动物细胞培育中纯化甲型肝炎病毒，其中第一步触及低成本阴离子交流层析法，以捕获产物并去除大量杂质，下游工艺的最后步骤是运用尺寸排阻层析法的精纯和脱盐步骤。一个简直完整基于学问的普通示例是平台工艺，将在下一段中更细致地解释。 平台工艺 平台工艺可用作“模板”，应用预先树立的一系列单元操作，针对特定类型的分子设计整个纯化序列。平台阐明提供了每个单元操作的操作条件的细致信息，对应于整个纯化流程。关键优势之一是减少了相似分子的工艺开发时间、相关监管和资源请求，从而降低了上市时间和考证工作。此外，平台文件不只能够在不同部门之间共享和匹配，还能够在不同的消费站点之间共享和匹配，成为一个无关站点的工艺。平台工艺措施最合适具有相似特征、继而相似纯化步骤的生物制药。例如，mAb的定义相对明白，平台工艺可用于为新的mAb 异构体树立相似的纯化流程。有关工艺相关污染物的细致信息，例如HCP 和相应细胞培育的其它杂质，即 CHO 和杂交瘤细胞，是已知的。纯化步骤的次第包含Protein A 层析、低 pH 病毒灭活、IEX层析精纯步骤、除病毒过滤以及超滤/洗滤。只需对纯化工艺条件中止微小更改即可肯定新的 mAb 异构体的纯化工艺。平台措施的其它潜在适用候选产品可能是 pDNA 疫苗和流感疫苗，其均具有相似的特性和纯化步骤。但是，mAb的性质相对相似，而蛋白质亚单位疫苗的表观差别很大，使得纯化工艺愈加难以规范化。 基于模型的下游工艺开发 在工艺工程中，模型发挥着重要作用，它们旨在以笼统的数学方式表示一个真实的系统。Bézivin和 Gerbé 将模型定义为“以预期目的构建的系统的简化。该模型应该能够替代实践系统回答问题”。与工艺工程相关的预期目的能够是控制、模仿、设计、监控或优化。依据目的，可能有不同的模型适用。模型有助于了解复杂的问题，并且假如模型能够充沛表示建模系统的目的特征，则能够提供潜在的处置计划。运用给定的一组参数运转模型即为模仿，是一种运转虚拟实验的低价且保险的措施。因而，能够减少和/或更有效地设计实验室中的实验次数，从而减少时间和资料耗费。固然运用模型听起来很有吸收力且很有前景，但开发能够完成预期目的的合理模型需求时间、肉体和学问。此外，该范畴缺乏能够开发、维护科学和工程软件的人员。在不久的未来，估量会有更多的工艺工程师或科学家会熟习建模，由于往常大多数技术相关研讨都提供编程和数据处置课程。为了树立一个模型，两个主要资源是必不可少的，即工艺学问，转化为自然规律，以及从真实系统中取得的数据的搜集。在工艺工程中，能够分辨第一原理、机械或学问驱动模型和数据驱动或阅历模型，分别称为透明白盒模型和不太透明的黑盒模型。两者的组合称为混合半参数模型。表 1概述了主要优点和缺陷。 数据驱动的模型 数据驱动或阅历模型试图依据预定义设计空间内的察看实验来描画输入-输出关系，例如人工神经网络 (ANN)、统计和回归模型。生物制药行业经常运用统计模型，经过运用DoE 和恰当的统计数据剖析措施（例如响应面措施(RSM)）执行一组预定义的实验，或者经过运用现有数据集中止多元数据剖析。RSM 是一个众所周知的阅历模型，它描画了DoE 内不同测试要素之间的响应关系，并生成了一个描画数学关系的模型。该统计（黑盒）模型仅察看要素与响应的相关性，而没有取得对估量参数的基本机械（物理化学）了解。经过一阶和二阶多项式应用DoE 和回归剖析，能够估量最佳输入组合。但是，将数据拟合到二阶多项式是RSM 的一个主要缺陷，由于通常并非系统内的一切曲率都能够用二阶多项式来描画。DoE与阅历模型相分离已普遍应用于生物制药行业和学术界的下游纯化工艺设计。有研讨人员运用DoE 和线性回归模型研讨了高盐溶液对 RNA 沉淀和 pDNA 回收的影响。最近，Chiang等人应用 DoE，评价了在从单柱操作切换到多柱操作时，层析参数对病毒肃清的影响。数据驱动模型的一个主要限制是它们仅在丈质变量的定义区域内有效，并且只能预测该区域内的变量，这使得外推通常十分不精确。此外，能够提取的工艺学问很少，由于参数通常只是相关性。另一方面，与机械建模相比，数据驱动建模不需求提早了解工艺，并且耗时更少。 机械建模 机械、第一原理的或学问驱动的模型试图依据有关工艺的学问来描画工艺或系统中发作的内部机制和现象。这些模型由物料和/或能量均衡以及传输和热力学现象组成，并具有固定的结构，这意味着参数可能具有物了解释。模型参数由实验数据或物理相关性估量。纯化过程中发作的物理过程能够转化为数学模仿模型。一个经过考证的机械模型允许在计算机中探求各种条件，因而能够有效地取得最佳操作条件。层析柱内发作的现象在文献中有很好的描画，Ruthven曾经深化引见了动力学和吸附过程。动力学或速率模型在理论中最常见，包含分散要素，如传质和分散效应，以及均衡要素，如吸附等温线、离子解离和分子间缔合。三个最突出的动力学模型是集中动力学模型、集中孔隙模型和普通速率模型，它们按复杂水平排列。这些模型的主要区别在于掩盖孔隙扩散效应的水平。但是，其适用于一切力学模型，等温线参数至关重要，如前文所述，其中存在许多分离模型，例如线性、Langmuir、空间质量作用和混合方式。层析模型的运用范围从工艺合成、优化和控制到放大、填料选择和稳健性研讨。进一步的步骤是模仿集成式层析和其它调理步骤的组合，以找到最佳整体纯化工艺。目前已有多种层析机械模型的商业化软件可供运用，例如：GoSilico（Cytivia子公司，正式称号为ChromX）、Aspen Chromatography、DelftChrom、CADET和ChromaTech。 用于吸附实验的计算机替代措施曾经研讨了几年。分子动力学模仿试图在细致的原子水平上描画填料-蛋白质之间的相互作用。定量构效关系 (QSAR) 将分子特性与阅历模型相分离，以发现保存行为和蛋白质名义特性之间的相关性。这种分子模型可用于预测蛋白质在填料上的保存行为，以减少工艺开发时间。但是，通常需求关于每个成分的细致信息，例如氨基酸序列或晶体结构，并且还需求大量的实验。 与数据驱动模型相比，机械模型能够探求更宽范围以至超出察看到的丈量结果的条件，具有更高的外推才干。这有助于工艺了解，契合QbD 倡议，固然机械建模也需求物理了解。基于学问的模型的主要缺陷是它们的复杂性，因而与数据驱动模型相比需求更多的开发时间。 混合（半参数）建模 混合（半参数）建模将参数（即基于第一原理、机械和学问的模型）与非参数（即数据驱动模型）相分离，以消弭个别措施的缺陷并充沛应用两者。Von Stosch等人普遍回想了混合半参数建模框架和生物化学工程中有关过程监测、控制、优化、模型缩减和放大的各种应用。参数和非参数模型能够串联或并联配置，细致取决于模型的范围。当机械（白盒）模型性能有限或不够精确时，通常倡议运用并行方式，并且添加非参数（黑盒）模型可能会改善评价，如图4c。串行措施通常用于经过运用非参数模型肯定参数来降低机械模型的复杂性，如图4a，或者当机械模型的结果作为非参数模型的输入时，如图4b。
图4. 混合建模配置，白盒表示机械/第一原理模型，黑盒表示数据驱动模型。串行措施 (A, B) 和并行措施(C)。 混合建模的有用性在于它能够经济高效地处置复杂问题并开发模型。除了取得更普遍的工艺了解外，其它优点还包含优化的模型精度、透明度和外推特性。但是，应战在于了解以何种方式能够组合不同类型的模型来开发混合模型。因而，需求对数据驱动模型和机械模型有透彻的了解，以及获取正确数据的学问。混合建模越来越遭到工业界和学术界的关注，并且似乎是抑止数据驱动和机械模型缺陷的一种很有出路的措施。 |
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